TIP120A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402506-ACT

CAND1 (TIP120A) codifica un fattore associato alle culline e dissociato dalla neddilazione che regola l’assemblaggio e il rimodellamento delle ubiquitina ligasi cullin-RING (CRL) promuovendo lo scambio dei recettori del substrato di tipo F-box. Attraverso questo controllo della dinamica delle CRL, TIP120A influenza la proteostasi dipendente dall’ubiquitina, la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno al DNA e le vie di trasduzione del segnale che dipendono dal tempestivo turnover delle proteine regolatorie. Un’alterata attività di CAND1 può perturbare la specificità di substrato delle CRL e il flusso di ubiquitinazione, generando effetti ampi sulla proliferazione e sull’adattamento allo stress, frequentemente oggetto di studio nella biologia del cancro e in altri disturbi dell’omeostasi proteica.

TIP120A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CAND1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TIP120A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CAND1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CAND1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TIP120A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CAND1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TIP120A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TIP120A nelle cellule tumorali con espressione di CAND1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.