TGase1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423374-ACT

O gene Tgm1 de camundongo codifica a transglutaminase 1 (TGase1), uma enzima dependente de Ca²⁺ que catalisa ligações cruzadas ε-(γ-glutamil)lisina entre proteínas estruturais para estabilizar o envelope córneo durante a diferenciação terminal dos queratinócitos. A atividade da TGase1 é essencial para a formação e a homeostase da barreira epidérmica, atuando em coordenação com programas de queratinização e com a remodelação da matriz extracelular na superfície celular. A função comprometida da TGase1 ou a expressão desregulada prejudicam a integridade da barreira cutânea, levando a descamação alterada, fenótipos mais propensos à inflamação e respostas prejudicadas ao estresse ambiental. Assim, o Tgm1 é amplamente estudado em vias que regulam a diferenciação epitelial, a biologia de barreira e os mecanismos de doenças de pele.

TGase1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Tgm1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TGase1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Tgm1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Tgm1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TGase1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Tgm1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TGase1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TGase1 em células tumorais com expressão de Tgm1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.