Su[fu] Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401599-ACT

SUFU (Suppressor of Fused) codifica a proteína humana Su[fu], um regulador negativo central da sinalização Hedgehog que restringe os fatores de transcrição GLI e ajuda a manter um nível adequado de atividade da via durante o desenvolvimento e a homeostase tecidual. Ao modular o processamento de GLI, sua localização nuclear e sua atividade transcricional, SUFU se integra à sinalização dependente do cílio primário e a redes mais amplas de controle transcricional. A desregulação de SUFU ou de componentes downstream da via Hedgehog está associada a sinalização proliferativa aberrante e a alterações na especificação do destino celular, tornando SUFU um ponto frequentemente estudado na reprogramação dessa via. A função de SUFU também é relevante em investigações sobre biologia de células-tronco/progenitoras, ciliopatias e contextos de sinalização oncogênica nos quais a transcrição dependente de GLI está alterada.

Su[fu] O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SUFU sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Su[fu] O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SUFU em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SUFU, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Su[fu]. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SUFU nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Su[fu] no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Su[fu] em células tumorais com expressão de SUFU silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.