Sucrase-Isomaltase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401348-ACT

Die humane SI kodiert für Sucrase-Isomaltase, eine Bürstensaum-Membran-Glykohydrolase, die für die terminale Verdauung von Nahrungs-Kohlenhydraten im Dünndarm essenziell ist. Der Enzymkomplex katalysiert die Hydrolyse von Saccharose sowie von α-1,4-/α-1,6-Bindungen in stärkeabgeleiteten Oligosacchariden und stellt damit Monosaccharide für die Resorption und den Energiestoffwechsel des Epithels bereit. Expression und intrazellulärer Transport von SI sind eng an Differenzierungsprogramme der Enterozyten und an die Prozessierung apikaler Membranproteine im sekretorischen Weg gekoppelt. Eine veränderte SI-Funktion oder -Expression ist mit Phänotypen einer Disaccharidase-Defizienz assoziiert und trägt zur Variabilität der intestinalen Kohlenhydratverwertung bei, die den Verlauf gastrointestinaler Erkrankungen beeinflussen kann.

Sucrase-Isomaltase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SI-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Sucrase-Isomaltase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SI-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SI-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Sucrase-Isomaltase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SI-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Sucrase-Isomaltase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Sucrase-Isomaltase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SI-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.