Sucrase-Isomaltase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401348-ACT

A SI humana codifica a sacarase-isomaltase, uma glico-hidrolase de membrana da borda em escova essencial para a digestão terminal de carboidratos da dieta no intestino delgado. O complexo enzimático catalisa a hidrólise da sacarose e de ligações α-1,4/α-1,6 em oligossacarídeos derivados do amido, sustentando a disponibilidade de monossacarídeos para absorção e para o metabolismo energético do epitélio. A expressão e o tráfego da SI estão intimamente ligados a programas de diferenciação dos enterócitos e ao processamento de proteínas da membrana apical na via secretória. Alterações na função ou na expressão da SI estão associadas a fenótipos de deficiência de dissacaridases e contribuem para a variabilidade no processamento intestinal de carboidratos, o que pode influenciar estados de doença gastrointestinal.

Sucrase-Isomaltase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SI sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Sucrase-Isomaltase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SI em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SI, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Sucrase-Isomaltase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SI nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Sucrase-Isomaltase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Sucrase-Isomaltase em células tumorais com expressão de SI silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.