Plásmido CRISPR de Activación (h) SSAT: sc-402916-ACT

El SAT1 humano codifica la espermidina/espermina N1-acetiltransferasa (SSAT), una enzima limitante de la velocidad en el catabolismo de las poliaminas que acetila la espermidina y la espermina para promover su exportación y su reconversión oxidativa. Al regular los reservorios intracelulares de poliaminas, SSAT influye en la organización de la cromatina, los programas transcripcionales, las respuestas al estrés oxidativo y la progresión del ciclo celular. La actividad de SAT1 se interseca con la biosíntesis de poliaminas y con el metabolismo de la metionina/de un carbono mediante el uso de acetil-CoA y el control por retroalimentación de la homeostasis de las poliaminas. La expresión desregulada de SAT1 y el recambio de poliaminas se han asociado con proliferación alterada, señalización inflamatoria, estrés metabólico y fenotipos relacionados con el cáncer, lo que lo convierte en un nodo útil para estudios mecanísticos de vías.

SSAT El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SAT1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SSAT El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SAT1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SAT1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SSAT. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SAT1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SSAT en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SSAT en células tumorales con expresión de SAT1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.