Plásmido CRISPR de Activación (h) Sec8: sc-405009-ACT

El EXOC4 humano codifica Sec8, un componente central del complejo exocisto octamérico que ancla las vesículas secretoras pos-Golgi a la membrana plasmática antes de la fusión de membranas dependiente de SNARE. Sec8 favorece la exocitosis polarizada, la entrega de proteínas de membrana y la coordinación del citoesqueleto, conectando el tráfico vesicular con la migración celular, el crecimiento de neuritas y los programas de polaridad epitelial. A través del tráfico dependiente del exocisto, EXOC4 influye en la señalización y en la disponibilidad de receptores en la superficie celular, con efectos posteriores sobre la capacidad de respuesta a factores de crecimiento y el mantenimiento de las uniones célula–célula. La desregulación de la función del exocisto, incluida la alteración de la actividad de EXOC4/Sec8, se ha asociado con defectos en la secreción y la polaridad que con frecuencia se estudian en el contexto del comportamiento invasivo y otros fenotipos celulares complejos relevantes para enfermedades.

Sec8 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de EXOC4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Sec8 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus EXOC4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional EXOC4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Sec8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo EXOC4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Sec8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Sec8 en células tumorales con expresión de EXOC4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.