RyR-1 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-401470-LAC

RYR1 codifica il recettore della rianodina 1 (RyR-1), un grande canale di rilascio del Ca²⁺ inserito nel reticolo sarcoplasmatico/endoplasmatico che accoppia la depolarizzazione di membrana al flusso intracellulare di Ca²⁺. Controllando il rapido rilascio di calcio indotto dal calcio e l’accoppiamento eccitazione–contrazione, RyR-1 coordina la segnalazione a valle dipendente dal Ca²⁺, che influenza il metabolismo, la funzione mitocondriale e programmi trascrizionali dipendenti dall’attività. Una funzione o un’espressione deregolata di RYR1 altera l’omeostasi del calcio ed è associata alla fisiopatologia del muscolo scheletrico, rendendolo un nodo centrale per lo studio delle reti di segnalazione del Ca²⁺ nei miociti umani e in modelli muscolari ingegnerizzati. La modulazione sperimentale di RYR1 è comunemente utilizzata per indagare il gating del canale, la dinamica dei depositi di Ca²⁺ e il cross-talk tra vie di segnalazione con risposte allo stress, come la proteostasi del RE/RS.

Le particelle di attivazione lentivirale RyR-1 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di RYR1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale RyR-1 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione RYR1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di RyR-1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo RYR1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.