RPE65 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-401489-ACT

RPE65は、網膜色素上皮における視覚サイクルに必須のレチノイド異性化加水分解酵素をコードしており、ロドプシン再生を維持するために、全トランス型レチニルエステルを11-シス-レチノールへ変換する反応を触媒します。この活性は、発色団の供給を維持することで光受容（フォトトランスダクション）を支えるとともに、レチノール輸送、エステル化、外網膜における酸化ストレス応答などを含む細胞プロセスとレチノイド代謝とを結び付けます。RPE65の発現量や機能の変化は、発色団リサイクルの障害と視細胞機能不全に関連しており、網膜恒常性を研究する上での重要な結節点となります。RPE65の調節を利用したin vitroモデルは、視覚サイクルの転写制御や、網膜変性の表現型に関連する下流シグナル伝達の変化を解析するために用いられています。

RPE65 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性RPE65の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

RPE65 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における RPE65 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はRPE65転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性RPE65の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のRPE65遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるRPE65依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびRPE65発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるRPE65経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。