RPA 32 kDa subunit CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401249-ACT

RPA2 kodiert die 32-kDa-Untereinheit des Replikationsproteins A (RPA), eines essenziellen heterotrimeren, einzelsträngige DNA bindenden Komplexes, der ssDNA‑Zwischenprodukte während der DNA-Replikation, Rekombination und Reparatur stabilisiert. Durch die Koordination der Checkpoint-Aktivierung und die Rekrutierung von Nukleasen, Helikasen und Reparaturpolymerasen unterstützt RPA2 die ATR-abhängige Signalgebung bei Replikationsstress und erhält während der S‑Phase die Integrität der Replikationsgabel. Die Funktion von RPA2 ist eng mit Mechanismen der Genomstabilität verknüpft, darunter die Nukleotid-Exzisionsreparatur, die homologe Rekombination und Netzwerke der DNA-Schadensantwort, die eine Mutationslast verhindern. Eine Fehlregulation der Aktivität des RPA-Komplexes und der Toleranz gegenüber Replikationsstress wird mit Phänotypen genomischer Instabilität in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und andere Störungen der DNA-Reparatur relevant sind.

RPA 32 kDa subunit Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RPA2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RPA 32 kDa subunit Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RPA2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RPA2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RPA 32 kDa subunit-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RPA2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RPA 32 kDa subunit-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RPA 32 kDa subunit-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RPA2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.