Romo1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417144-ACT

ROMO1 (modulatore 1 delle specie reattive dell’ossigeno) codifica Romo1, una piccola proteina di membrana mitocondriale che regola l’omeostasi intracellulare delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) e la segnalazione redox. La produzione di ROS guidata da Romo1 influenza la dinamica mitocondriale, il potenziale di membrana e le risposte allo stress ossidativo, intersecando vie che controllano la proliferazione cellulare, l’apoptosi e la segnalazione infiammatoria. Un’espressione disregolata di ROMO1 è stata riportata in molteplici contesti di cancro e malattie metaboliche, nei quali un equilibrio redox alterato può sostenere la sopravvivenza delle cellule tumorali, la resistenza alle terapie e la disfunzione mitocondriale. In quanto modulatore dei ROS mitocondriali, ROMO1 è spesso studiato per il suo impatto sul danno ossidativo, sui programmi trascrizionali di adattamento allo stress e sulle cascate di segnalazione dipendenti dai ROS.

Romo1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ROMO1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Romo1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ROMO1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ROMO1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Romo1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ROMO1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Romo1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Romo1 nelle cellule tumorali con espressione di ROMO1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.