Rho G Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402608-ACT

RHOG codifica Rho G, un membro della famiglia Rho delle piccole GTPasi che funziona da interruttore molecolare collegando segnali extracellulari al rimodellamento del citoscheletro di actina. Nel suo stato legato al GTP, Rho G coordina eventi di segnalazione che regolano la formazione di ruffling di membrana, l’adesione cellulare, l’endocitosi e la migrazione direzionale attraverso interazioni con effettori a valle e crosstalk con le vie di Rac1 e Cdc42. Questi processi influenzano il traffico delle cellule immunitarie, le risposte fagocitiche e la crescita dei neuriti, rendendo RHOG un nodo utile per studiare la dinamica del citoscheletro e la segnalazione guidata dai recettori. Un’attività deregolata di Rho G è stata associata ad alterazioni della motilità cellulare e a un comportamento invasivo in contesti rilevanti per la malattia, a supporto di indagini meccanicistiche nella biologia del cancro e in modelli di segnalazione infiammatoria.

Rho G Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RHOG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rho G Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RHOG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RHOG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rho G. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RHOG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rho G nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rho G nelle cellule tumorali con espressione di RHOG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.