RANKL Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400304-ACT

TNFSF11 codifica RANKL, una citochina della superfamiglia del TNF che funge da ligando chiave per il recettore RANK (TNFRSF11A) regolando la differenziazione, l’attivazione e la sopravvivenza degli osteoclasti. La segnalazione indotta da RANKL coinvolge adattatori TRAF per attivare le cascate NF-κB e MAPK, collegando segnali immunitari al rimodellamento osseo e alle risposte infiammatorie. Oltre ai suoi ruoli nell’osteoimmunologia, RANKL contribuisce all’organogenesi dei linfonodi e influenza la comunicazione tra cellule dendritiche e cellule T. Un’attività deregolata dell’asse RANKL/RANK/OPG è associata a perdita ossea patologica e a fenotipi di rimodellamento, ed è frequentemente studiata nel contesto di alterazioni scheletriche associate all’infiammazione e delle interazioni tra tumore e microambiente osseo.

RANKL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TNFSF11 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RANKL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TNFSF11 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TNFSF11, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RANKL. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TNFSF11 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RANKL nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RANKL nelle cellule tumorali con espressione di TNFSF11 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.