Plasmide CRISPR d'Activation (h) RAMP1: sc-401396-ACT

La protéine 1 modulatrice de l’activité des récepteurs (RAMP1) est une sous-unité accessoire transmembranaire à passage unique qui contrôle le trafic, la spécificité vis-à-vis des ligands et la sortie de signalisation des complexes de GPCR de classe B, notamment en s’associant au récepteur apparenté au récepteur de la calcitonine (CALCRL) pour former le récepteur canonique du CGRP. En modulant la maturation du récepteur et sa localisation à la surface cellulaire, RAMP1 influence la signalisation cAMP/PKA induite par le CGRP ainsi que les programmes transcriptionnels en aval qui régulent le tonus neurovasculaire et les réponses inflammatoires médiées par des neuropeptides. La signalisation dépendante de RAMP1 a été largement impliquée dans les mécanismes à l’origine de la biologie de la migraine et, plus largement, dans des processus neurovasculaires et liés à la douleur ; elle est également étudiée dans la régulation cardiovasculaire et la physiologie des voies aériennes. Par conséquent, la modulation de l’expression de RAMP1 est utile pour disséquer la fonction des protéines accessoires des GPCR, la pharmacologie des récepteurs et les biais de signalisation dépendants du contexte dans des modèles cellulaires humains pertinents.

RAMP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAMP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RAMP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAMP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAMP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RAMP1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAMP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RAMP1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RAMP1 dans les cellules tumorales présentant une expression de RAMP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.