Polycystin-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400669-ACT

PKD2 codifica a policistina-2, um canal de cátions não seletivo permeável a Ca2+ que se localiza nos cílios primários, no retículo endoplasmático e na membrana plasmática, onde ajuda a regular a sinalização mecanossensorial de cálcio. A policistina-2 interage com a policistina-1 e contribui para o controle da homeostase intracelular de Ca2+, da polaridade celular e da morfogênese de túbulos epiteliais, integrando sinais que influenciam programas de proliferação e diferenciação. A sinalização dependente de PKD2 cruza-se com respostas associadas a cAMP e MAPK e modula a sinalização dependente do fluxo de fluido em epitélios renais. A disrupção genética ou a desregulação de PKD2 está fortemente associada à doença renal policística autossômica dominante e a fenótipos císticos relacionados, tornando-o um alvo-chave para o estudo de mecanismos de ciliopatias.

Polycystin-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PKD2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Polycystin-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PKD2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PKD2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Polycystin-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PKD2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Polycystin-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Polycystin-2 em células tumorais com expressão de PKD2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.