Perlecan CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420986-ACT

Mouse-Hspg2 kodiert Perlecan, ein großes Heparansulfat-Proteoglykan der Basalmembranen und perizellulären Matrizes, das die Architektur der extrazellulären Matrix organisiert und die Zell–Matrix-Signalübertragung moduliert. Perlecan bindet Wachstumsfaktoren wie FGF und VEGF und wirkt mit Integrinen und anderen Proteoglykanen zusammen, um Adhäsion, Migration, Mechanotransduktion und angiogene Antworten zu regulieren; dabei beeinflusst es unter anderem Signalwege wie FGF/FGFR, VEGF/VEGFR sowie PI3K–AKT/ERK. Während der Entwicklung und der Gewebehomöostase trägt Perlecan zur Integrität von Knorpel und Gefäßen, zur Organisation der neuromuskulären Endplatte und zur Funktion der Filtrationsbarriere bei. Eine Fehlregulation der Hspg2-/Perlecan-Biologie wurde in präklinischen Krankheitsmodellen mit Basalmembran-Erkrankungen, Skelettdysplasien und dem Remodeling des Tumormikromilieus in Verbindung gebracht und macht Hspg2 zu einem relevanten Ziel für Studien zur extrazellulären Matrix und Signalgebung.

Perlecan Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Hspg2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Perlecan Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Hspg2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Hspg2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Perlecan-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Hspg2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Perlecan-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Perlecan-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Hspg2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.