PDH-E1α CRISPR Activationプラスミド (h): sc-401044-ACT

PDHA1は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）複合体のE1αサブユニットをコードする。PDH複合体はミトコンドリア内に存在する多酵素複合体で、ピルビン酸をアセチルCoAへ酸化的脱炭酸する反応を触媒し、解糖系とトリカルボン酸（TCA）回路および酸化的リン酸化を連結している。PDH-E1αの機能は、PDH活性のリン酸化依存的な制御によって厳密に調節されており、栄養状態に応じて炭素フラックス、レドックスバランス、ATP産生を協調的に制御する。PDHA1の発現変動やPDH複合体の機能不全は、代謝リプログラミング、ミトコンドリア呼吸の障害、乳酸アシドーシス様の表現型と関連し、神経代謝疾患およびミトコンドリア疾患研究の観点から重要である。中心炭素代謝における中核的ノードとして、PDHA1は酸化ストレス、低酸素応答、ならびにバイオエネルギー適応のモデルで頻繁に研究されている。

PDH-E1α CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性PDHA1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

PDH-E1α CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における PDHA1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPDHA1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性PDH-E1αの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPDHA1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるPDH-E1α依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPDHA1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるPDH-E1α経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。