PBGD CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420870-ACT

Das murine Hmbs-Gen kodiert die Porphobilinogen-Deaminase (PBGD), ein zytosolisches Enzym, das die Polymerisation von vier Porphobilinogen-Molekülen zur Bildung von Hydroxymethylbilan katalysiert, einem zentralen Zwischenprodukt im Häm-Biosyntheseweg. Durch die Sicherstellung der Hämverfügbarkeit beeinflusst PBGD die mitochondriale Atmung, die Funktion der Cytochrome und die Redox-Homöostase, mit nachgeschalteten Effekten auf die erythroide Reifung und den zellulären oxidativen Stoffwechsel. Eine Störung der HMBS/PBGD-Aktivität ist mit einer dysregulierten Porphyrinverwertung und der Anreicherung vorgelagerter Zwischenprodukte verbunden, wodurch dieses Gen einen wichtigen Knotenpunkt für die Modellierung von Stoffwechselstressantworten darstellt. Hmbs ist daher relevant für Studien zur Leber- und hämatopoetischen Physiologie, zur mitochondrialen Bioenergetik sowie zur Regulation der Tetrapyrrol-Synthese auf Signalweg-Ebene.

PBGD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Hmbs-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PBGD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Hmbs-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Hmbs-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PBGD-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Hmbs-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PBGD-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PBGD-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Hmbs-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.