PBGD CRISPR Activationプラスミド (m): sc-420870-ACT

マウスHmbsは、細胞質酵素であるポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（PBGD）をコードしており、4分子のポルフォビリノーゲンを重合して、ヘム生合成経路の中心的な中間体であるヒドロキシメチルビランを生成します。PBGDはヘムの利用可能性を支えることで、ミトコンドリア呼吸、シトクロム機能、レドックス恒常性に影響を与え、その下流で赤芽球の成熟や細胞の酸化的代謝にも作用します。HMBS/PBGD活性の攪乱は、ポルフィリン代謝の異常や上流中間体の蓄積と関連しており、この遺伝子は代謝ストレス応答をモデル化するうえで重要な結節点となります。そのためHmbsは、肝臓および造血系の生理、ミトコンドリアの生体エネルギー学、ならびにテトラピロール合成の経路レベルの制御に関する研究において重要です。

PBGD CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性Hmbsの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

PBGD CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における Hmbs 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はHmbs転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性PBGDの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のHmbs遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるPBGD依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびHmbs発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるPBGD経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。