P504S CRISPR Activationプラスミド (h): sc-403603-ACT

ヒトのAMACRは、α-メチルアシルCoAラセマーゼ（P504S）をコードしており、ペルオキシソームおよびミトコンドリアに局在する酵素として、（R）体と（S）体の2-メチル分岐アシルCoAチオエステルを相互変換し、その後のβ酸化を可能にします。この活性は、分岐鎖脂肪酸や胆汁酸中間体の異化（分解）を支え、AMACRを脂質代謝恒常性およびペルオキシソーム—ミトコンドリア間クロストークと結び付けます。AMACR発現の異常調節や脂肪酸酸化プログラムの変化は、腫瘍に伴う代謝リモデリングと関連づけられており、AMACRはがん生物学において広く用いられる分子マーカーとなっています。そのためAMACRは、ヒト細胞における代謝経路依存性、レドックスバランス、ならびに脂質由来シグナル伝達を研究する上で重要です。

P504S CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性AMACRの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

P504S CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における AMACR 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はAMACR転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性P504Sの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のAMACR遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるP504S依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびAMACR発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるP504S経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。