p22-phox Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400325-ACT

CYBA codifica a p22-phox, uma subunidade essencial, ligada à membrana, do complexo NADPH oxidase de fagócitos, que estabiliza as subunidades catalíticas NOX e dá suporte à montagem da maquinaria de transferência de elétrons necessária para a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Por meio da sinalização redox dependente de NOX, a p22-phox contribui para a defesa imune inata, a regulação de cascatas de sinalização inflamatória e a modulação de processos vasculares e metabólicos. Alterações na função ou na expressão de CYBA têm sido associadas a estresse oxidativo desregulado e a fenótipos inflamatórios, com relevância para quadros de imunodeficiência e para a patobiologia cardiometabólica e vascular. Em células humanas, CYBA é frequentemente estudado para dissecar a regulação do complexo NOX, a produção compartimentalizada de ROS e eventos de sinalização a jusante, como a ativação das vias MAPK e NF-κB.

p22-phox O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CYBA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

p22-phox O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CYBA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CYBA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de p22-phox. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CYBA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de p22-phox no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via p22-phox em células tumorais com expressão de CYBA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.