nephrin CRISPR Activationプラスミド (h): sc-400368-ACT

NPHS1はネフリン（nephrin）をコードしており、ネフリンはポドサイトのスリット膜の中核を成す膜貫通型の免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質で、糸球体濾過バリアに必須です。ネフリンは細胞間接着に関与し、NCKなどのアダプタータンパク質との相互作用を介してシグナル伝達プラットフォームを組織化することで、細胞外のスリット膜構造をアクチン細胞骨格の再編成やPI3K/AKT関連経路と結び付けます。NPHS1の発現異常やネフリン輸送の破綻はポドサイト構造を損ない透過性を増大させるため、蛋白尿性腎疾患の機序研究における中心的な分子ノードとなっています。ヒト腎生物学モデルでは、NPHS1はポドサイトの分化状態、濾過バリアの完全性、ならびに細胞骨格や接着結合の制御に収束するストレス応答を評価するために、常用される指標です。

nephrin CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性NPHS1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

nephrin CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における NPHS1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はNPHS1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性nephrinの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のNPHS1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるnephrin依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびNPHS1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるnephrin経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。