MIA3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403994-ACT

A MIA3 humana (melanoma inhibitory activity family member 3), também conhecida como TANGO1, é uma proteína de suporte residente no retículo endoplasmático (RE) essencial para organizar os sítios de saída do RE e acoplar a montagem do revestimento COPII à secreção de cargas volumosas. Ao coordenar o carregamento de procolagénio e a biogénese de vesículas, a MIA3 sustenta a deposição da matriz extracelular e a homeostase tecidual, ligando a proteostase do RE à capacidade da via secretória. O tráfego dependente de MIA3 cruza-se com a biossíntese de colagénio, a sinalização da resposta a proteínas mal dobradas e programas de remodelação do estroma. A desregulação da atividade de MIA3 tem sido associada a alterações na organização da matriz e a fenótipos de stress secretório relevantes para fibrose, defeitos do desenvolvimento e biologia do microambiente tumoral.

MIA3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MIA3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MIA3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MIA3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MIA3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MIA3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MIA3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MIA3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MIA3 em células tumorais com expressão de MIA3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.