MCM4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402451-ACT

MCM4 umano codifica una subunità centrale del complesso elicasi MCM2–7, che abilita (“licenzia”) le origini di replicazione e guida lo svolgimento della doppia elica del DNA durante la fase S. Coordinando l’attivazione delle origini, la progressione delle forcelle di replicazione e le risposte dei checkpoint replicativi, MCM4 contribuisce alla stabilità del genoma nell’ambito delle vie della replicazione del DNA e della risposta al danno al DNA. Alterazioni dell’attività di MCM4 possono favorire stress replicativo, collasso delle forcelle e accumulo di lesioni del DNA, processi associati all’instabilità cromosomica osservata nella biologia del cancro e in altri disordini proliferativi. Di conseguenza, MCM4 è ampiamente utilizzato come nodo meccanicistico per studiare il controllo del ciclo cellulare, la segnalazione dello stress replicativo e il crosstalk tra vie di riparazione del DNA.

MCM4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MCM4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MCM4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MCM4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MCM4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MCM4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MCM4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MCM4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MCM4 nelle cellule tumorali con espressione di MCM4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.