LRRK2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-426167-ACT

Leucin-reiche Repeat-Kinase 2 (LRRK2) ist eine große, multidomänige Serin/Threonin-Kinase und GTPase, die über Interaktionen mit Rab-GTPasen und zugehörigen Signalnetzwerken den vesikulären Transport, die endolysosomale Homöostase, die Zytoskelettdynamik und die Autophagie koordiniert. In Mauszellen beeinflusst die Lrrk2-Aktivität die phosphorylierungsabhängige Umgestaltung von Membrantransportwegen und verknüpft angeborene Immunantworten sowie mitochondriale Qualitätskontrolle mit der zellulären Anpassung an Stress. Eine fehlregulierte LRRK2-Signalübertragung wurde umfassend im Zusammenhang mit neurodegenerationsassoziierten Mechanismen untersucht, darunter veränderte Proteostase, beeinträchtigte Lysosomenfunktion und abweichende entzündliche Signalgebung. Diese Eigenschaften machen Lrrk2 zu einem nützlichen Knotenpunkt, um das Zusammenspiel von Signalwegen zwischen neuronaler Aufrechterhaltung, Glia-Aktivierung und intrazellulärem Transport zu analysieren.

LRRK2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Lrrk2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LRRK2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Lrrk2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Lrrk2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LRRK2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Lrrk2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LRRK2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LRRK2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Lrrk2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.