LRG-47 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421030-ACT

Il gene murino **Irgm1** codifica **LRG-47**, una GTPasi correlata all’immunità inducibile dagli interferoni, che si localizza alle membrane intracellulari e sostiene la difesa cellulo-autonoma contro patogeni intracellulari. LRG-47 partecipa ai programmi antimicrobici guidati da **IFN-γ** coordinando il traffico vescicolare, la maturazione del fagosoma e processi legati all’autofagia che influenzano il contenimento e l’eliminazione dei patogeni. Interagisce con reti di segnalazione dell’immunità innata che modulano gli stati di attivazione dei macrofagi e gli output infiammatori, collegando le risposte agli interferoni al rimodellamento degli organelli. Un’attività disregolata di **Irgm1** è stata associata a una suscettibilità alterata alle infezioni e a immunopatologie, rendendolo rilevante per studi sulle interazioni ospite–patogeno e sui meccanismi delle malattie infiammatorie.

LRG-47 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Irgm1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LRG-47 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Irgm1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Irgm1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LRG-47. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Irgm1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LRG-47 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LRG-47 nelle cellule tumorali con espressione di Irgm1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.