Plásmido CRISPR de Activación (h) LNX4: sc-412056-ACT

El gen humano PDZRN4 codifica LNX4, una ligasa E3 de ubiquitina tipo RING que contiene dominios PDZ, implicada en la regulación dependiente de ubiquitina del recambio proteico y en la organización de complejos de señalización. A través de sus interacciones mediadas por PDZ, se considera que LNX4 influye en el tráfico y la estabilidad de receptores y proteínas andamiaje, modelando vías posteriores que gobiernan la polaridad celular, la adhesión y la diferenciación. Como parte de la red más amplia de la familia LNX, PDZRN4 es relevante para estudios de proteostasis y de la remodelación de la transducción de señales que acompaña a las respuestas al estrés celular y a la transformación oncogénica. La expresión alterada o los programas de ubiquitinación desregulados que involucran complejos asociados a PDZRN4 se han explorado en contextos de biología tumoral y neurobiología, lo que respalda su utilidad como diana de investigación mecanística.

LNX4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PDZRN4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

LNX4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PDZRN4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PDZRN4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de LNX4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PDZRN4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de LNX4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía LNX4 en células tumorales con expresión de PDZRN4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.