Limd1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404413-ACT

LIMD1 (LIM domains containing 1) codifica una proteina scaffold che si localizza nel nucleo e in complessi associati alle adesioni focali, integrando segnali che regolano la trascrizione, l’organizzazione del citoscheletro e il controllo del ciclo cellulare. Limd1 partecipa a reti di interazione proteina–proteina che influenzano l’output della via Hippo e altri programmi di regolazione della crescita modulando la disponibilità e l’attività di co-regolatori trascrizionali. Attraverso questi ruoli, LIMD1 è comunemente studiata in contesti di proliferazione, adesione e risposte allo stress alterate, in cui la sua disregolazione è frequentemente associata a fenotipi simili a quelli di un soppressore tumorale. L’analisi funzionale di LIMD1 aiuta a chiarire i meccanismi che collegano il contatto cellulare, la meccanotrasduzione e il controllo dell’espressione genica nelle cellule umane.

Limd1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LIMD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Limd1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LIMD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LIMD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Limd1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LIMD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Limd1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Limd1 nelle cellule tumorali con espressione di LIMD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.