Plasmide CRISPR d'Activation (h) KV1.5: sc-404341-ACT

KCNA5 code pour le canal potassique humain voltage‑dépendant KV1.5, une sous‑unité α apparentée à Shaker qui conduit le courant rectificateur retardé ultrarapide et contribue au contrôle de la repolarisation membranaire et de l’excitabilité. L’activité de KV1.5 module la durée du potentiel d’action, la fréquence de décharge et la signalisation couplée au calcium en ajustant le potentiel de membrane au repos et les propriétés réfractaires dans des cellules excitables comme non excitables. Par sa contribution à l’homéostasie électrophysiologique, KCNA5 est souvent étudié dans des voies reliant les flux ioniques à des programmes transcriptionnels, à la demande métabolique et aux réponses au stress. Une expression ou une fonction dérégulée de KCNA5/KV1.5 a été associée à des phénotypes de troubles du rythme cardiaque, au remodelage du muscle lisse vasculaire et à une signalisation proliférative altérée, ce qui soutient sa pertinence dans des modèles mécanistiques de canalopathies.

KV1.5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KCNA5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KV1.5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KCNA5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KCNA5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KV1.5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KCNA5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KV1.5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KV1.5 dans les cellules tumorales présentant une expression de KCNA5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.