KLK4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404256-ACT

KLK4 kodiert die kallikreinverwandte Peptidase 4, eine sezernierte Serinprotease, die zur extrazellulären Proteolyse und zur Umgestaltung der perizellulären Mikroumgebung beiträgt. Durch die Prozessierung von Matrix- und signalassoziierten Substraten kann KLK4 Proteasekaskaden, Programme der epithelialen Differenzierung und die parakrine Kommunikation innerhalb drüsiger Gewebe beeinflussen. Eine dysregulierte KLK4-Expression und Proteaseaktivität wurde mit veränderter Gewebehomöostase und tumorassoziiertem Remodeling in Verbindung gebracht, was seine Verwendung als funktioneller Knotenpunkt in Studien zu invasionsbezogenen Phänotypen und proteaseregulierter Signalübertragung stützt. KLK4 wird zudem zusammen mit anderen Kallikreinen untersucht, um eine koordinierte Regulation innerhalb proteolytischer Netzwerke und deren nachgeschaltete Effekte auf das Zellverhalten zu kartieren.

KLK4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KLK4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KLK4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KLK4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KLK4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KLK4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KLK4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KLK4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KLK4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KLK4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.