IKKβ Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421074-ACT

Ikbkb codifica l’inibitore della chinasi IκB del fattore nucleare kappa B, subunità beta (IKKβ), un componente catalitico centrale del complesso IKK che fosforila le proteine IκB per innescare la traslocazione nucleare di NF-κB e l’attivazione di programmi trascrizionali. Nelle cellule murine, IKKβ integra segnali provenienti dal recettore del TNF, dal recettore dell’IL-1 e dai recettori di riconoscimento dei pattern (PRR) per coordinare l’immunità innata, la produzione di citochine infiammatorie, la sopravvivenza cellulare e le risposte allo stress. Questa chinasi interagisce anche con la segnalazione MAPK e con la regolazione metabolica attraverso un crosstalk con le vie legate all’insulina e a mTOR. La deregolazione della segnalazione IKKβ–NF-κB è ampiamente utilizzata come modello meccanicistico negli studi su infiammazione cronica, autoimmunità, infezioni e segnalazione associata ai tumori, senza implicare esiti terapeutici.

IKKβ Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ikbkb senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IKKβ Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ikbkb nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ikbkb, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IKKβ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ikbkb nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IKKβ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IKKβ nelle cellule tumorali con espressione di Ikbkb silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.