Plasmide CRISPR d'Activation (h) HCN2: sc-405074-ACT

HCN2 code le canal 2 activé par l’hyperpolarisation et modulé par les nucléotides cycliques (Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide–gated channel 2), une sous-unité formant le pore qui conduit le courant Ih et couple l’hyperpolarisation membranaire à un flux entrant dépolarisant de cations. En intégrant la détection du voltage à une modulation directe par les nucléotides cycliques, HCN2 contribue à ajuster l’excitabilité neuronale, l’activité pacemaker et les propriétés de décharge rythmique, influençant l’intégration des signaux et les oscillations des réseaux. La fonction de HCN2 s’articule avec les voies de signalisation liées à l’AMPc/PKA et des programmes électrophysiologiques plus larges qui façonnent la réactivité synaptique et la régulation génique dépendante de l’excitabilité. Une expression dérégulée de HCN2 ou une activité anormale du canal a été associée à des phénotypes d’excitabilité altérés pertinents pour des troubles neurologiques et des atteintes du système sensoriel, étayant des études mécanistiques dans des tissus excitables et des modèles cellulaires pertinents pour la maladie.

HCN2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HCN2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HCN2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HCN2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HCN2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HCN2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HCN2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HCN2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HCN2 dans les cellules tumorales présentant une expression de HCN2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.