GPT CRISPR Activationプラスミド (h): sc-402909-ACT

ヒトのGPTは、ミトコンドリア酵素であるアラニンアミノトランスフェラーゼ2をコードしており、アラニンとα-ケトグルタル酸の間の可逆的なトランスアミネーション反応を触媒して、ピルビン酸とグルタミン酸を生成します。この反応を介してGPTは、アミノ酸利用をTCA回路、アナプレロシス（補充反応）、および窒素代謝と結び付け、ミトコンドリアのバイオエネルギー維持とレドックス恒常性を支えます。GPT活性は、糖新生フラックス、脂質代謝、栄養状態の変化に対する細胞応答に影響する、より広範な代謝プログラムとも関連しています。トランスアミナーゼ関連代謝の破綻は、代謝ストレス状態や、がんに伴うミトコンドリアの炭素・窒素フローの再配線でしばしば認められるため、GPTは状況依存的な代謝脆弱性を研究する上で有用なノードとなります。

GPT CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性GPTの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

GPT CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における GPT 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はGPT転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性GPTの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のGPT遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるGPT依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびGPT発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるGPT経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。