GM130 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400787-ACT

GOLGA2 kodiert das cis-Golgi-Matrixprotein GM130, eine Kernkomponente des Golgin-Netzwerks, das die Architektur des Golgi-Bandes aufrechterhält und das Andocken sowie die Fusion von Vesikeln koordiniert. GM130 ist über Interaktionen mit Proteinen wie GRASP65 und der Vesikel-Andockmaschinerie an Transportprozessen vom ER zum Golgi sowie an der mitotischen Zerlegung und Wiederzusammensetzung des Golgi beteiligt und verknüpft damit die Dynamik des sekretorischen Weges mit dem Fortschreiten des Zellzyklus. Störungen der GM130-abhängigen Organisation können Proteinglykosylierung, Membrantransport und Organellenpositionierung verändern – Prozesse, die häufig mit Invasion von Krebszellen, Neurodegeneration und angeborenen Erkrankungen mit beeinträchtigter Sekretion in Zusammenhang stehen.

GM130 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GOLGA2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GM130 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GOLGA2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GOLGA2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GM130-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GOLGA2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GM130-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GM130-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GOLGA2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.