GIT1 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-402136-ACT

ヒトGIT1（G protein-coupled receptor kinase-interacting protein 1）は、ARF GTPase活性化タンパク質（GAP）関連の足場（スキャフォールド）因子であり、フォーカルアドヒージョンのターンオーバー、受容体トラフィッキング、アクチン細胞骨格のリモデリングを統合的に制御します。GRK、パキシリン、ならびにエンドサイトーシス複合体や接着複合体の構成要素などとの相互作用を介して、GIT1はGPCRや受容体型チロシンキナーゼからのシグナルを、細胞移動、ラメリポディアのダイナミクス、シナプス／神経細胞の組織化を制御する経路へと取り込み、統合するのに寄与します。GIT1に関連するシグナル伝達は、浸潤性の細胞挙動、血管新生および血管応答、さらに接着と細胞骨格制御が重要となる神経発生過程などの文脈で研究されてきました。そのため、GIT1の発現異常やネットワーク結合性の変化は、がん細胞の運動性に関する機序研究、炎症シグナルのクロストーク、神経学的表現型の理解において重要です。

GIT1 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性GIT1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

GIT1 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における GIT1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はGIT1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性GIT1の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のGIT1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるGIT1依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびGIT1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるGIT1経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。