FKHRL1/FOXO3a CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400308-ACT

FOXO3 (FKHRL1/FOXO3a) ist ein Forkhead-Box-Transkriptionsfaktor, der die Insulin/IGF-1–PI3K–AKT-Signalübertragung mit zellulären Stressantworten verknüpft, um Gene zu regulieren, die Apoptose, Zellzyklusarrest, Reparatur von DNA-Schäden, Autophagie und antioxidative Abwehr steuern. Die Phosphorylierung durch AKT fördert den Ausschluss von FOXO3 aus dem Zellkern, während oxidativer Stress und AMPK-abhängige Signale die nukleäre Aktivität und Transkriptionsprogramme begünstigen, die mit metabolischer Homöostase und Überleben verknüpft sind. FOXO3 steht außerdem in Wechselwirkung mit TGF-β-, MAPK- und mTOR-Signalwegen und beeinflusst so Differenzierung sowie immunologische und inflammatorische Outputs in unterschiedlichen Zelltypen. Eine veränderte Regulation von FOXO3 wurde mit Tumorbiologie, neurodegenerativen Prozessen, kardiometabolischen Phänotypen und altersassoziierten Merkmalen in Verbindung gebracht, was es zu einem häufigen Knotenpunkt für mechanistische Untersuchungen der Stressadaptation macht.

FKHRL1/FOXO3a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FOXO3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FKHRL1/FOXO3a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FOXO3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FOXO3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FKHRL1/FOXO3a-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FOXO3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FKHRL1/FOXO3a-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FKHRL1/FOXO3a-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FOXO3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.