FIG4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404404-ACT

FIG4 codifica uma fosfoinositídeo 5-fosfatase do tipo SAC que regula a renovação do fosfatidilinositol 3,5-bisfosfato (PI(3,5)P2), um sinal lipídico essencial para a dinâmica das membranas endolisossomais. Por meio do acoplamento funcional com o complexo PIKfyve, FIG4 ajuda a controlar o tráfego vesicular, a homeostase de vacúolos/lisossomos, o fluxo autofágico e os eventos de fissão–fusão de membranas que moldam a maturação dos endossomos. A perturbação da atividade de FIG4 desorganiza o equilíbrio de fosfoinositídeos e está associada a defeitos na manutenção neuronal e na biologia da mielina, refletindo a elevada sensibilidade do sistema nervoso ao estresse endolisossomal. Por isso, FIG4 é frequentemente estudado em modelos de neurodegeneração e neuropatia periférica, nos quais a disfunção lisossomal e o tráfego comprometido são mecanismos centrais.

FIG4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FIG4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FIG4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FIG4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FIG4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FIG4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FIG4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FIG4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FIG4 em células tumorais com expressão de FIG4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.