Plasmide CRISPR d'Activation (h) Eps8: sc-403249-ACT

EPS8 (Eps8) code un substrat de la voie EGFR qui intègre la signalisation des récepteurs à activité tyrosine kinase au remodelage du cytosquelette d’actine. Eps8 fonctionne au sein de complexes avec des protéines adaptatrices telles qu’ABI1 et SOS1 afin de réguler l’activation de Rac, la formation de replis membranaires (membrane ruffling) et le contrôle dynamique des filopodes et des lamellipodes, reliant les signaux des facteurs de croissance à la forme cellulaire et à la motilité. Par ces fonctions, il influence notamment des processus tels que l’endocytose, l’adhésion et la propagation du signal en aval des réseaux EGFR/ERBB. Une expression d’EPS8 altérée ou un couplage anormal à la voie a été associé à une migration dérégulée et à une signalisation proliférative dans de multiples contextes cellulaires pertinents pour la maladie, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques de la signalisation du cytosquelette.

Eps8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EPS8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Eps8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EPS8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EPS8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Eps8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EPS8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Eps8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Eps8 dans les cellules tumorales présentant une expression de EPS8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.