EAAT1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400917-ACT

SLC1A3 kodiert den exzitatorischen Aminosäuretransporter 1 (EAAT1), einen hochaffinen, natriumabhängigen Transporter für Glutamat und Aspartat, der die extrazelluläre Glutamat-Homöostase aufrechterhält und exzitotoxische Signalübertragung begrenzt. EAAT1 wird vor allem in Astrozyten stark exprimiert und trägt zum Glutamat-Glutamin-Zyklus bei, indem er die Entfernung von Neurotransmittern mit dem zellulären Energiestoffwechsel und den Ionengradienten koppelt. Indem SLC1A3 die synaptische Transmission mitprägt und neuronale Netzwerke vor übermäßiger glutamaterger Aktivität schützt, beeinflusst es neuroentwicklungsbedingte und neurodegenerative Prozesse. Eine veränderte EAAT1-Expression oder -Funktion wurde mit gestörter Glutamat-Signalübertragung in neurologischen und psychiatrischen Krankheitskontexten in Verbindung gebracht, was seinen Einsatz in mechanistischen Studien der exzitatorischen Neurotransmission stützt.

EAAT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC1A3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EAAT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC1A3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC1A3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EAAT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC1A3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EAAT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EAAT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC1A3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.