DPYD CRISPR Activationプラスミド (h): sc-403396-ACT

ヒトのDPYDは、細胞質に局在するフラボタンパク質であるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼをコードし、ウラシルおよびチミンの律速段階の還元反応を触媒して、ピリミジン分解（異化）を開始します。ピリミジンのターンオーバーを制御することで、DPYDはヌクレオチド恒常性、RNA/DNA前駆体のバランス、ならびに代謝ストレスに対する細胞応答に影響を与えます。DPYD活性の変化は、ピリミジン代謝の先天異常やフルオロピリミジンの処理能の個体差と関連づけられており、この経路が神経発達研究および薬理ゲノミクスの文脈と結び付くことを示しています。そのためDPYDは、代謝制御、酸化還元生化学、そして増殖や細胞フィットネスに対する経路レベルの影響を研究するうえで有用な結節点となります。

DPYD CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性DPYDの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

DPYD CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における DPYD 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はDPYD転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性DPYDの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のDPYD遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるDPYD依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびDPYD発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるDPYD経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。