Plasmide CRISPR/Cas9 KO DNA Ligase IV (m): sc-435638
- Espèces cibles: mouse
- 20 µg d'ADN plasmidique purifié et prêt à transfecter; Jusqu'à 20 transfections
- DNA Ligase IV Le plasmide CRISPR/Cas9 Knockout (KO) (m) est un ensemble de plasmides, chacun codant pour la nucléase Cas9 et un ARN guide (gRNA) de 20 nt spécifique à la cible, conçu pour une efficacité de knockout maximale à l'aide de séquences issues de la bibliothèque GeCKO v2
- Les séquences d'ARN guide (gRNA) dirigent Cas9 pour induire des cassures double brin (DSB) spécifiques au site dans le locus génomique DNA Ligase IV, entraînant un knock-out génique par jonction non homologue (NHEJ)
- Le plasmide HDR DNA Ligase IV (m) (sc-435638-HDR) est recommandé pour une co-transfection avec le plasmide CRISPR/Cas9 KO DNA Ligase IV (m) afin de permettre la sélection des cellules éditées avec succès grâce à l'intégration, médiée par HDR, d'un cassette de résistance à la puromycine et d'un gène rapporteur RFP
- Le plasmide HDR DNA Ligase IV (m) est un ensemble de plasmides, chacun contenant un matrice de réparation dirigée par homologie (HDR) correspondant aux sites cibles de l'ARN guide (gRNA) dans le plasmide CRISPR/Cas9 KO DNA Ligase IV (m)
- Chaque plasmide HDR contient deux bras d'homologie d'environ 800 pb flanquant les cassettes de résistance à la puromycine et RFP, conçus pour se lier aux séquences d'ADN génomique entourant le site de cassure double brin induit par Cas9 et faciliter une intégration précise médiée par HDR
- Les gènes de résistance à la puromycine et RFP sont flanqués de sites LoxP, permettant la suppression des marqueurs de sélection via la recombinase Cre (Cre Vector : sc-418923) après l'établissement de lignées cellulaires knock-out stables
- Après transfection, l'efficacité de knockout de gène peut être évaluée par WB, IF ou IHC en utilisant l'anticorps: DNA Ligase IV Antibody (D-8): sc-271299
Informations pour la commande
| Nom du produit | Ref. Catalogue | COND. | Prix HT | QTÉ | Favoris | |
Plasmide CRISPR/Cas9 KO DNA Ligase IV (m) | sc-435638 | 20 µg | $397.00 | |||
Plasmid HDR DNA Ligase IV (m) | sc-435638-HDR | 20 µg | $445.00 |
Présentation
Chez la souris, Lig4 code la ligase IV de l’ADN, une ligase dépendante de l’ATP qui catalyse l’étape finale de jonction des brins dans la voie classique de jonction d’extrémités non homologues (c-NHEJ) lors de la réparation des cassures double brin de l’ADN. La ligase IV de l’ADN fonctionne en complexe avec XRCC4 et est stabilisée par XLF/NHEJ1, coordonnant le traitement des extrémités et la ligation afin de préserver l’intégrité du génome après une irradiation ionisante, un stress oxydant et des dommages associés à la réplication. L’activité de Lig4 est également requise pour la recombinaison V(D)J et la recombinaison de commutation isotypique, ce qui l’associe au développement des lymphocytes et à la formation du répertoire immunitaire. La perturbation de cette voie est liée à l’instabilité chromosomique, à une signalisation altérée des dommages à l’ADN et à des phénotypes pertinents pour la recherche sur l’immunodéficience et la biologie du cancer.
Le DNA Ligase IV CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m) est un ensemble de plasmides conçus pour la disruption ciblée du gène Lig4 dans les lignées cellulaires mouse. Chaque plasmide du pool co-exprime un sgRNA unique, ciblant un site distinct au sein du locus Lig4, ainsi que la nucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes, et code pour la GFP afin de permettre l'identification par fluorescence et l'enrichissement des cellules transfectées avec succès. Cette stratégie multi-guide augmente la probabilité d'induire des décalages de cadre ou des délétions produisant un knock-out fonctionnel, offrant ainsi une alternative plus robuste aux approches à guide unique. Les cassures double brin (DSB) induites à plusieurs sites sont résolues par jonction non homologue (NHEJ) ou, lorsqu'elles sont utilisées avec le modèle donneur HDR inclus, par réparation dirigée par homologie (HDR) à un site cible défini au sein du locus.
Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec le donneur HDR exprimant la RFP, les fluorescences GFP et RFP peuvent être utilisées conjointement pour distinguer les populations de cellules transfectées de celles éditées, rationalisant ainsi les workflows de tri par cytométrie en flux et de sélection de clones.
Donneur de réparation dirigée par homologie (HDR) — Cassette de puromycine avec rapporteur RFP
Pour les applications nécessitant des clones knock-out confirmés et sélectionnables, le DNA Ligase IV plasmide HDR (m) comprend une construction donneuse HDR contenant une cassette de résistance à la puromycine (PuroR) et un rapporteur protéine fluorescente rouge (RFP), flanquée de bras d'homologie spécifiques à un site cible Lig4 défini.
Lorsqu'il est co-transfecté avec le plasmide DNA Ligase IV CRISPR/Cas9 KO (m):
- La cassette PuroR-RFP s'intègre au site de coupure de Cas9 via HDR, perturbant le cadre de lecture ouvert Lig4.
La fluorescence RFP fournit un indicateur visuel immédiat de la réussite de l'intégration, permettant l'identification ou le tri par fluorescence des cellules éditées avant ou parallèlement à la sélection par la puromycine.
Les cellules éditées avec succès sont confirmées par leur résistance à la puromycine, ce qui réduit considérablement la charge de criblage des clones.
Cette stratégie de sélection est idéale pour générer des lignées cellulaires KO clonales stables destinées à des études fonctionnelles en aval, au criblage de médicaments ou au développement de modèles.
Système de suppression de la cassette Cre-lox
La construction donneuse HDR comporte des sites loxP flanquant la cassette de sélection PuroR-RFP afin de permettre une suppression propre du marqueur après confirmation du clone. L'expression transitoire de la recombinase Cre via le vecteur Cre inclus Cre Vector: sc-418923 excise la cassette, laissant un site loxP résiduel minimal au sein du locus Lig4 et éliminant les effets de confusion potentiels sur les tests en aval.
Cette approche en deux étapes :
- Minimise la perturbation de l'architecture locale de la chromatine et des éléments régulateurs voisins
Restaure un contexte génomique quasi-naturel au niveau du locus édité
Permet la réutilisation de la stratégie de sélection à la puromycine dans la même lignée cellulaire pour des modifications supplémentaires
Caractéristiques principales
- gRNA ciblant le ou les exons Lig4 essentiels à la fonction DNA Ligase IV
Co-expression de SpCas9 et de sgRNA à partir d'un seul plasmide pour une administration simplifiée
Donneur HDR avec résistance à la puromycine pour une sélection positive des clones
Cassette PuroR flanquée de loxP avec vecteur de recombinase Cre pour une suppression transparente du marqueur
Fourni prêt à l'emploi pour une administration par transfection
Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.