Plásmido Doble Nickase (h) DHODH: sc-402983-NIC

La DHODH (dihidroorotato deshidrogenasa) humana es una flavoproteína de la membrana interna mitocondrial que cataliza la oxidación limitante de la velocidad del dihidroorotato a orotato en la biosíntesis de novo de pirimidinas, acoplando la producción de nucleótidos a la cadena respiratoria mediante la ubiquinona. Al controlar la disponibilidad de UMP, la DHODH influye en la síntesis de ADN/ARN, la progresión de la fase S y la capacidad proliferativa, y contribuye a la reprogramación metabólica bajo estrés nutricional. La actividad de DHODH vincula la bioenergética mitocondrial con la homeostasis de nucleótidos y puede modular el equilibrio redox mediante la transferencia de electrones a la cadena de transporte de electrones. La desregulación del metabolismo de las pirimidinas y la dependencia alterada de DHODH se han implicado en contextos de rápida división celular y disfunción mitocondrial, lo que convierte a la DHODH en un nodo útil para estudiar vulnerabilidades metabólicas y la regulación del ciclo celular.

DHODH El plásmido de doble nicasa (h) consiste en un par de plásmidos emparejados diseñados para la edición de alta especificidad del locus DHODH en líneas celulares human. Cada plásmido expresa una nicasa Cas9 D10A y un ARN guía específico (sgRNA) dirigido a cadenas de ADN opuestas dentro de DHODH. Cuando se dirigen a sitios adyacentes en cadenas de ADN opuestas, las dos nicasas generan cortes en cadena simple desplazados que, juntos, producen una rotura de doble cadena escalonada, lo que requiere una actividad coordinada sobre el objetivo por parte de ambas guías. La rotura de ADN resultante se resuelve mediante vías de reparación celular endógenas, más comúnmente a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ), lo que da lugar a inserciones o deleciones que alteran la función de DHODH. Al requerir la participación de dos ARN guía en el locus diana, el enfoque de doble corte mejora la especificidad de la edición y proporciona una estrategia CRISPR complementaria para aplicaciones en las que se desea un control adicional sobre la precisión de la orientación.

Para facilitar la identificación eficiente de las células editadas, un plásmido codifica GFP para la visualización fluorescente de las poblaciones transfectadas, mientras que el plásmido complementario lleva un gen de resistencia a la puromicina para la selección con antibióticos. En conjunto, estas características facilitan el enriquecimiento eficiente de las poblaciones cotransfectadas y simplifican la validación de los clones con DHODH alterado.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.