cystatin A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416374-ACT

Il gene umano **CSTA** codifica la **cistatina A**, una cistatina intracellulare di tipo I che inibisce le proteasi cisteiniche di tipo papaina, come le catepsine B, H e L, modulando così la proteolisi, la processazione dell’antigene e l’omeostasi cellulare associata alla funzione di barriera. Limitando l’attività proteasica lisosomiale e citosolica, la cistatina A contribuisce alla regolazione della differenziazione dei cheratinociti, dell’integrità epiteliale e delle risposte allo stress legate all’equilibrio tra proteasi e antiproteasi. Un’espressione deregolata di CSTA è stata associata a condizioni infiammatorie cutanee e al rimodellamento epiteliale; inoltre, le alterazioni della dinamica cistatina–catepsina sono spesso oggetto di studio nelle ricerche su invasione tumorale, segnalazione immunitaria e turnover della matrice extracellulare. Di conseguenza, CSTA rappresenta un nodo utile per analizzare le vie controllate dalle proteasi che influenzano adesione cellulare, migrazione e morte cellulare programmata.

cystatin A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CSTA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cystatin A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CSTA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CSTA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cystatin A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CSTA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cystatin A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cystatin A nelle cellule tumorali con espressione di CSTA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.