Plasmide CRISPR d'Activation (h) CPS2: sc-403519-ACT

Le gène humain CAD code une enzyme multifonctionnelle contenant le domaine carbamoyl‑phosphate synthétase 2 (CPS2) et catalyse les étapes engagées, limitantes en vitesse, de la biosynthèse de novo des pyrimidines. En soutenant la production d’UTP et de CTP, l’activité de CAD relie le métabolisme des nucléotides à la synthèse de l’ADN/ARN, à la progression du cycle cellulaire et aux réponses au stress de réplication, avec une régulation coordonnée par des voies de signalisation sensibles aux facteurs de croissance et aux nutriments, telles que mTORC1 et la phosphorylation dépendante de la voie MAPK. Des perturbations du flux de pyrimidines médié par CAD peuvent influencer la stabilité du génome et les programmes transcriptionnels dans les cellules à prolifération rapide, ce qui en fait un nœud clé pour étudier le contrôle métabolique de la prolifération et l’homéostasie des acides nucléiques. Un métabolisme des pyrimidines dérégulé et une expression altérée de CAD ont été observés dans plusieurs contextes pertinents pour les maladies, notamment le remodelage métabolique associé aux cancers et des troubles neurométaboliques héréditaires, ce qui renforce l’intérêt de cette voie comme cible de recherche.

CPS2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CAD sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CPS2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CAD dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CAD, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CPS2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CAD natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CPS2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CPS2 dans les cellules tumorales présentant une expression de CAD silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.