Plásmido CRISPR de Activación (h) COL4A4: sc-404186-ACT

COL4A4 codifica la cadena alfa 4 del colágeno tipo IV, un componente estructural central de las membranas basales que se ensambla en redes heterotriméricas de colágeno tipo IV que sostienen las interfaces epiteliales y endoteliales. Estas redes regulan la organización de la matriz extracelular, la adhesión celular, la polaridad y la función de barrera tisular, e influyen en procesos de señalización como las vías mediadas por integrinas y la mecanotransducción dependiente de la matriz. En la membrana basal glomerular del riñón, COL4A4 contribuye a la arquitectura de filtración y a la estabilidad de la matriz, y la alteración de su función se asocia con nefropatías hereditarias, incluidos los trastornos del espectro de Alport y los fenotipos de membrana basal delgada. La desregulación de la composición del colágeno tipo IV también afecta microambientes vasculares y epiteliales relevantes para la investigación de la fibrosis y la remodelación tisular.

COL4A4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de COL4A4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

COL4A4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus COL4A4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional COL4A4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de COL4A4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo COL4A4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de COL4A4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía COL4A4 en células tumorales con expresión de COL4A4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.