Plásmido CRISPR de Activación (h) CNT1: sc-404790-ACT

SLC28A1 codifica el transportador concentrativo de nucleósidos 1 (CNT1), un transportador de membrana plasmática de alta afinidad y dependiente de sodio que media la captación celular de nucleósidos pirimidínicos como la uridina y la citidina. Al controlar la vía de rescate de nucleósidos, CNT1 contribuye a la homeostasis del pool de nucleótidos necesario para la síntesis de ADN/ARN, la progresión del ciclo celular y las respuestas al estrés metabólico. La actividad de CNT1 se relaciona con el metabolismo de purinas y pirimidinas y puede influir en la sensibilidad a perturbaciones experimentales basadas en análogos de nucleósidos mediante cambios en la disponibilidad intracelular de sustratos. Se ha descrito una expresión desregulada de SLC28A1 en múltiples contextos patológicos, incluido el reprogramamiento metabólico asociado al cáncer, lo que lo hace relevante para estudios de biología de transportadores, proliferación y mecanismos de transporte de fármacos.

CNT1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SLC28A1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CNT1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SLC28A1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SLC28A1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CNT1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SLC28A1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CNT1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CNT1 en células tumorales con expresión de SLC28A1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.