Plasmide CRISPR d'Activation (h) Cdc45: sc-401882-ACT

CDC45 code pour Cdc45, un composant essentiel de l’hélicase CMG (CDC45–MCM2-7–GINS), qui autorise et entraîne le déroulement de l’ADN aux origines de réplication durant la phase S. En coordonnant l’activation des origines et la progression des fourches de réplication, Cdc45 contribue à la stabilité du génome et s’inscrit dans les réponses au stress de réplication de l’ADN ainsi que dans la signalisation des points de contrôle. Une altération de la fonction ou de l’expression de CDC45 a été associée à des défauts de réplication, à l’instabilité chromosomique et à des phénotypes prolifératifs pertinents pour la biologie du cancer et certaines maladies du développement, ce qui en fait un nœud utile pour étudier la dynamique de la réplication et le contrôle du cycle cellulaire.

Cdc45 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CDC45 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Cdc45 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CDC45 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CDC45, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Cdc45. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CDC45 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Cdc45 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Cdc45 dans les cellules tumorales présentant une expression de CDC45 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.