Cdc4 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m): sc-424472

Übersicht

Fbxw7 kodiert das F-Box/WD-Repeat-Protein Cdc4, eine Substraterkennungskomponente der SCF-(SKP1–CUL1–RBX1)-E3-Ubiquitin-Ligase, die phosphorylierte Proteine für den ubiquitinabhängigen proteasomalen Abbau markiert. Cdc4 trägt zur Kontrolle von Zellzyklusprogression, Wachstum und Differenzierung bei, indem es den Abbau zentraler Regulatoren wie Cyclin E, c-Myc, Notch, Jun und Effektoren des mTOR-Signalwegs fördert und so Phosphorylierungs-Signale mit der Proteinstabilität verknüpft. In Mausmodellen wird Fbxw7 häufig eingesetzt, um Ubiquitin-Signalgebung, mitotische Kontrolle sowie die Homöostase von Stamm- und Vorläuferzellen zu untersuchen. Eine Fehlregulation oder ein Funktionsverlust von FBXW7 ist mit genomischer Instabilität und onkogener Signalübertragung assoziiert, weshalb es in der Krebsbiologie und der Erforschung von Tumorsuppressor-Signalwegen oft im Fokus steht.

Cdc4 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des Fbxw7-Gens in mouse-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid im Pool koexprimiert eine einzigartige sgRNA, die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des Fbxw7-Lokus abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease, und kodiert für GFP, um die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen zu ermöglichen. Diese Multi-Guide-Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, Frameshifts oder Deletionen zu induzieren, die zu einem funktionellen Knockout führen, und bietet damit eine robustere Alternative zu Single-Guide-Ansätzen. An mehreren Stellen induzierte DSBs werden durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder, bei Verwendung mit der enthaltenen HDR-Donor-Matrize, durch homologe Reparatur (HDR) an einer definierten Zielstelle innerhalb des Lokus repariert.

Bei Verwendung in Verbindung mit dem RFP-exprimierenden HDR-Donor können GFP- und RFP-Fluoreszenz gemeinsam genutzt werden, um transfizierte von editierten Zellpopulationen zu unterscheiden, was die auf Durchflusszytometrie basierenden Sortier- und Klonauswahl-Workflows optimiert.

Homology-Directed Repair (HDR)-Donor — Puromycin-Kassette mit RFP-Reporter

Für Anwendungen, die bestätigte, selektierbare Knockout-Klone erfordern, enthält das Cdc4 HDR-Plasmid (m) ein HDR-Donorkonstrukt mit einer Puromycin-Resistenzkassette (PuroR) und einem Reporter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP), flankiert von Homologiearmen, die für eine definierte Fbxw7 Zielstelle spezifisch sind.
Bei Co-Transfektion mit dem Cdc4 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m):

• Die PuroR-RFP-Kassette integriert sich über HDR an der Cas9-Schnittstelle und unterbricht dabei das Fbxw7 offene Lesegerüst.
  Die RFP-Fluoreszenz liefert einen unmittelbaren visuellen Hinweis auf eine erfolgreiche Integration und ermöglicht die fluoreszenzbasierte Identifizierung oder Sortierung editierter Zellen vor oder parallel zur Puromycin-Selektion.
  Erfolgreich editierte Zellen werden durch Puromycin-Resistenz bestätigt, was den Aufwand für das Klon-Screening erheblich reduziert.
  Diese Selektionsstrategie eignet sich ideal zur Erzeugung stabiler, klonaler KO-Zelllinien für nachgelagerte Funktionsstudien, Wirkstoffscreenings oder die Modellentwicklung.

Cre-lox-Kassetten-Entfernungssystem

Das HDR-Donorkonstrukt verfügt über loxP-Stellen, die die PuroR-RFP-Selektionskassette flankieren, um eine saubere Markerentfernung nach der Klonbestätigung zu ermöglichen. Die transiente Expression der Cre-Rekombinase über das enthaltene Cre-Vektor: sc-418923 schneidet die Kassette heraus, wobei eine minimale Rest-loxP-Stelle innerhalb des Fbxw7-Lokus verbleibt und potenzielle Störeffekte auf nachgeschaltete Assays eliminiert werden.
Dieser zweistufige Ansatz:

• Minimiert Störungen der lokalen Chromatinarchitektur und benachbarter regulatorischer Elemente
  Stellt einen nahezu nativen genomischen Kontext am editierten Locus wieder her
  Ermöglicht die Wiederverwendung der Puromycin-Selektionsstrategie in derselben Zelllinie für weitere Editierungen

Hauptmerkmale

• gRNA, die auf Fbxw7 Exon(e) abzielt, die für die Cdc4 Funktion entscheidend sind
  Koexpression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid für eine vereinfachte Verabreichung
  HDR-Donor mit Puromycin-Resistenz für die positive Klonselektion
  loxP-flankierte PuroR-Kassette mit Cre-Rekombinase-Vektor für die nahtlose Markerentfernung
  Wird gebrauchsfertig für die Verabreichung durch Transfektion geliefert

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.