CCT A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404021-ACT

PCYT1A codifica a citidililtransferase de colina-fosfato A (CCT A), a enzima limitante da via do CDP-colina (Kennedy), que gera fosfatidilcolina, um dos principais lípidos estruturais das membranas eucarióticas. Ao controlar a síntese de fosfatidilcolina, a CCT A influencia a biogénese de membranas, a dinâmica das gotículas lipídicas e a homeostase do RE (retículo endoplasmático) e do Golgi, ligando a disponibilidade de lípidos à função dos organelos e ao crescimento celular. A atividade de PCYT1A articula-se com uma remodelação mais ampla dos fosfolípidos e com o metabolismo das lipoproteínas, moldando a composição das membranas e a competência de sinalização. Alterações na função de PCYT1A estão associadas a doenças hereditárias do metabolismo de fosfolípidos e podem afetar respostas celulares ao stress e programas de diferenciação relevantes para fenótipos metabólicos e do neurodesenvolvimento.

CCT A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PCYT1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CCT A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PCYT1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PCYT1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CCT A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PCYT1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CCT A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CCT A em células tumorais com expressão de PCYT1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.