BTLA Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-431543-ACT

Btla codifica o atenuador de linfócitos B e T (BTLA), um imunorreceptor inibitório da família CD28 que limita a ativação de linfócitos e ajuda a manter a tolerância periférica. A sinalização de BTLA é iniciada pela interação com HVEM (TNFRSF14) e recruta fosfatases por meio de motivos ITIM/ITSM para atenuar a sinalização proximal ao receptor de antígeno, reduzindo a produção de citocinas, a proliferação e a diferenciação efetora. Em células imunes de camundongos, o BTLA contribui para a regulação de programas semelhantes à exaustão de células T, respostas de centro germinativo e o controle de sinais inflamatórios em tecidos linfoides. Vias de BTLA desreguladas são amplamente relevantes para estudos de autoimunidade, inflamação crônica, remodelamento imune induzido por infecção e imunologia tumoral no contexto da biologia de checkpoints imunológicos.

BTLA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Btla sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BTLA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Btla em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Btla, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BTLA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Btla nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BTLA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BTLA em células tumorais com expressão de Btla silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.