Bcl10 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h2): sc-400483-KO-2

Übersicht

BCL10 kodiert Bcl10, einen essenziellen Adapter in der Antigenrezeptor‑Signalübertragung, der über den CARD11–BCL10–MALT1‑(CBM-)Komplex die Kopplung upstream gelegener Rezeptoren an die Aktivierung von NF‑κB vermittelt. Nach Aktivierung des T‑Zell‑ oder B‑Zell‑Rezeptors fördert Bcl10 den Aufbau von Signalgerüsten und unterstützt die Aktivierung des IKK‑Komplexes, zytokinresponsive Transkriptionsprogramme sowie Überlebensprogramme; darüber hinaus bestehen Verknüpfungen zu MAPK‑ und entzündlichen Signalwegen. Eine dysregulierte BCL10‑Expression, Translokationen oder eine abnorme CBM‑Signalgebung wurden mit Immunfunktionsstörungen und der Biologie lymphoider Malignome in Verbindung gebracht, weshalb BCL10 häufig Ziel mechanistischer Studien ist. In humanen Zellmodellen stört der Verlust von Bcl10 die NF‑κB‑abhängige Genexpression und kann genutzt werden, um Signalwege zu untersuchen, die Aktivierung, Apoptose sowie das Zusammenspiel angeborener und adaptiver Immunantworten steuern.

Bcl10 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h2) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des BCL10-Gens in human-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid im Pool koexprimiert eine einzigartige sgRNA, die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des BCL10-Lokus abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease, und kodiert für GFP, um die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen zu ermöglichen. Diese Multi-Guide-Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, Frameshifts oder Deletionen zu induzieren, die zu einem funktionellen Knockout führen, und bietet damit eine robustere Alternative zu Single-Guide-Ansätzen. An mehreren Stellen induzierte DSBs werden durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder, bei Verwendung mit der enthaltenen HDR-Donor-Matrize, durch homologe Reparatur (HDR) an einer definierten Zielstelle innerhalb des Lokus repariert.

Bei Verwendung in Verbindung mit dem RFP-exprimierenden HDR-Donor können GFP- und RFP-Fluoreszenz gemeinsam genutzt werden, um transfizierte von editierten Zellpopulationen zu unterscheiden, was die auf Durchflusszytometrie basierenden Sortier- und Klonauswahl-Workflows optimiert.

Homology-Directed Repair (HDR)-Donor — Puromycin-Kassette mit RFP-Reporter

Für Anwendungen, die bestätigte, selektierbare Knockout-Klone erfordern, enthält das Bcl10 HDR-Plasmid (h2) ein HDR-Donorkonstrukt mit einer Puromycin-Resistenzkassette (PuroR) und einem Reporter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP), flankiert von Homologiearmen, die für eine definierte BCL10 Zielstelle spezifisch sind.
Bei Co-Transfektion mit dem Bcl10 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h2):

• Die PuroR-RFP-Kassette integriert sich über HDR an der Cas9-Schnittstelle und unterbricht dabei das BCL10 offene Lesegerüst.
  Die RFP-Fluoreszenz liefert einen unmittelbaren visuellen Hinweis auf eine erfolgreiche Integration und ermöglicht die fluoreszenzbasierte Identifizierung oder Sortierung editierter Zellen vor oder parallel zur Puromycin-Selektion.
  Erfolgreich editierte Zellen werden durch Puromycin-Resistenz bestätigt, was den Aufwand für das Klon-Screening erheblich reduziert.
  Diese Selektionsstrategie eignet sich ideal zur Erzeugung stabiler, klonaler KO-Zelllinien für nachgelagerte Funktionsstudien, Wirkstoffscreenings oder die Modellentwicklung.

Cre-lox-Kassetten-Entfernungssystem

Das HDR-Donorkonstrukt verfügt über loxP-Stellen, die die PuroR-RFP-Selektionskassette flankieren, um eine saubere Markerentfernung nach der Klonbestätigung zu ermöglichen. Die transiente Expression der Cre-Rekombinase über das enthaltene Cre-Vektor: sc-418923 schneidet die Kassette heraus, wobei eine minimale Rest-loxP-Stelle innerhalb des BCL10-Lokus verbleibt und potenzielle Störeffekte auf nachgeschaltete Assays eliminiert werden.
Dieser zweistufige Ansatz:

• Minimiert Störungen der lokalen Chromatinarchitektur und benachbarter regulatorischer Elemente
  Stellt einen nahezu nativen genomischen Kontext am editierten Locus wieder her
  Ermöglicht die Wiederverwendung der Puromycin-Selektionsstrategie in derselben Zelllinie für weitere Editierungen

Hauptmerkmale

• gRNA, die auf BCL10 Exon(e) abzielt, die für die Bcl10 Funktion entscheidend sind
  Koexpression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid für eine vereinfachte Verabreichung
  HDR-Donor mit Puromycin-Resistenz für die positive Klonselektion
  loxP-flankierte PuroR-Kassette mit Cre-Rekombinase-Vektor für die nahtlose Markerentfernung
  Wird gebrauchsfertig für die Verabreichung durch Transfektion geliefert

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.