Plásmido CRISPR de Activación (h) BBS8: sc-404755-ACT

TTC8 codifica BBS8, un componente central del complejo BBSome que coordina el transporte de carga hacia y desde el cilio primario, apoyando la clasificación de proteínas de la membrana ciliar y procesos vinculados al transporte intraflagelar. Mediante la regulación de la señalización dependiente de cilios, incluido el tráfico de Sonic hedgehog y de GPCR, BBS8 ayuda a mantener la polaridad celular y la señalización sensorial en múltiples tejidos. La alteración genética o la disfunción de BBS8 se asocia con el síndrome de Bardet–Biedl y ciliopatías relacionadas, que presentan fenotipos pleiotrópicos compatibles con una estructura y señalización ciliares alteradas. En modelos celulares humanos, la perturbación de la expresión de TTC8 proporciona un enfoque manejable para estudiar la proteostasis ciliar, el transporte vesicular y la reconfiguración de vías aguas abajo de una señalización ciliar modificada.

BBS8 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TTC8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

BBS8 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TTC8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TTC8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de BBS8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TTC8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de BBS8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía BBS8 en células tumorales con expresión de TTC8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.